IPTG (ఐసోప్రొపైల్-β-D-థియోగాక్టోసైడ్) అనేది β-గాలక్టోసైడేస్ సబ్స్ట్రేట్ యొక్క ఒక అనలాగ్, ఇది అధికంగా ప్రేరేపించబడుతుంది. IPTG ప్రేరణ కింద, ప్రేరకం నిరోధక ప్రోటీన్తో ఒక సంక్లిష్టాన్ని ఏర్పరుస్తుంది, తద్వారా నిరోధక ప్రోటీన్ యొక్క ఆకృతి మార్చబడుతుంది, దానివల్ల అది లక్ష్య జన్యువుతో కలవలేకపోతుంది, మరియు లక్ష్య జన్యువు సమర్థవంతంగా వ్యక్తీకరించబడుతుంది. అయితే ప్రయోగం సమయంలో IPTG గాఢతను ఎలా నిర్ణయించాలి? గాఢత ఎంత ఎక్కువగా ఉంటే అంత మంచిదా?
మొదట, IPTG ప్రేరణ సూత్రాన్ని అర్థం చేసుకుందాం: E. coli యొక్క లాక్టోస్ ఆపెరాన్ (మూలకం)లో Z, Y, మరియు A అనే మూడు నిర్మాణాత్మక జన్యువులు ఉంటాయి, ఇవి వరుసగా β-గాలక్టోసిడేస్, పెర్మియేస్, మరియు ఎసిటైల్ట్రాన్స్ఫరేస్లను సంకేతీకరిస్తాయి. lacZ లాక్టోస్ను గ్లూకోజ్ మరియు గాలక్టోస్గా, లేదా అల్లో-లాక్టోస్గా జలవిశ్లేషణ చేస్తుంది; lacY పరిసరాలలోని లాక్టోస్ను కణ త్వచం గుండా ప్రయాణించి కణంలోకి ప్రవేశించడానికి అనుమతిస్తుంది; lacA ఎసిటైల్-CoA నుండి ఎసిటైల్ సమూహాన్ని β-గాలక్టోసైడ్కు బదిలీ చేస్తుంది, ఇది విష ప్రభావాన్ని తొలగించడంలో సహాయపడుతుంది. అదనంగా, ఒక ఆపరేటింగ్ సీక్వెన్స్ O, ఒక ప్రారంభ సీక్వెన్స్ P మరియు ఒక నియంత్రణ జన్యువు I ఉంటాయి. I జన్యువు ఒక రిప్రెసర్ ప్రోటీన్ను సంకేతీకరిస్తుంది, ఇది ఆపరేటర్ సీక్వెన్స్ యొక్క O స్థానానికి బంధించగలదు, తద్వారా ఆపెరాన్ (మెటా) అణచివేయబడి ఆపివేయబడుతుంది. ప్రారంభ క్రమం P కి ముందు భాగంలో విచ్ఛిన్న జన్యు క్రియాశీలక ప్రోటీన్-CAP బంధన స్థానం కూడా ఉంది. P క్రమం, O క్రమం మరియు CAP బంధన స్థానం కలిసి లాక్ ఆపెరాన్ యొక్క నియంత్రణ ప్రాంతాన్ని ఏర్పరుస్తాయి. జన్యు ఉత్పత్తుల సమన్వయ వ్యక్తీకరణను సాధించడానికి, ఈ మూడు ఎంజైమ్ల కోడింగ్ జన్యువులు ఒకే నియంత్రణ ప్రాంతం ద్వారా నియంత్రించబడతాయి.
లాక్టోస్ లేనప్పుడు, లాక్ ఆపెరాన్ (మెటా) నిరోధిత స్థితిలో ఉంటుంది. ఈ సమయంలో, PI ప్రమోటర్ సీక్వెన్స్ నియంత్రణలో I సీక్వెన్స్ ద్వారా వ్యక్తమయ్యే లాక్ రిప్రెసర్, O సీక్వెన్స్కు బంధించబడుతుంది. ఇది RNA పాలిమరేస్ P సీక్వెన్స్కు బంధించకుండా నిరోధించి, ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ప్రారంభాన్ని అడ్డుకుంటుంది; లాక్టోస్ ఉన్నప్పుడు, లాక్ ఆపెరాన్ (మెటా) ప్రేరేపించబడుతుంది. ఈ ఆపెరాన్ (మెటా) వ్యవస్థలో, అసలైన ప్రేరకం లాక్టోస్ కాదు. లాక్టోస్ కణంలోకి ప్రవేశించి, β-గాలక్టోసిడేస్ ద్వారా ఉత్ప్రేరక చర్యకు గురై అల్లోలాక్టోస్గా మార్చబడుతుంది. ఈ అల్లోలాక్టోస్, ఒక ప్రేరక అణువుగా, రిప్రెసర్ ప్రోటీన్కు బంధించబడి, ప్రోటీన్ ఆకృతిని మారుస్తుంది. ఇది రిప్రెసర్ ప్రోటీన్ O సీక్వెన్స్ నుండి విడిపోవడానికి మరియు ట్రాన్స్క్రిప్షన్కు దారితీస్తుంది. ఐసోప్రొపైల్థియోగాక్టోసైడ్ (IPTG) కూడా అల్లోలాక్టోస్ మాదిరిగానే ప్రభావాన్ని చూపుతుంది. ఇది చాలా శక్తివంతమైన ప్రేరకం, ఇది బ్యాక్టీరియా ద్వారా జీవక్రియకు గురికాదు మరియు చాలా స్థిరంగా ఉంటుంది, అందువల్ల దీనిని ప్రయోగశాలలలో విస్తృతంగా ఉపయోగిస్తారు.
IPTG యొక్క సరైన గాఢతను ఎలా నిర్ణయించాలి? E. coli ని ఉదాహరణగా తీసుకోండి.
పాజిటివ్ రీకాంబినెంట్ pGEX (CGRP/msCT) కలిగిన E. coli BL21 జన్యుపరంగా మార్పు చేయబడిన స్ట్రెయిన్ను, 50μg·mL-1 Amp కలిగిన LB ద్రవ మాధ్యమంలోకి ఇనాక్యులేట్ చేసి, 37°C వద్ద రాత్రంతా కల్చర్ చేశారు. పైన పేర్కొన్న కల్చర్ను విస్తరణ కల్చర్ కోసం, 50μg·mL-1 Amp కలిగిన 50mL తాజా LB ద్రవ మాధ్యమం ఉన్న 10 సీసాలలోకి 1:100 నిష్పత్తిలో ఇనాక్యులేట్ చేశారు, మరియు OD600 విలువ 0.6~0.8 ఉన్నప్పుడు, IPTGని 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 తుది గాఢతకు చేర్చారు. అదే ఉష్ణోగ్రత మరియు అదే సమయంలో ప్రేరేపించిన తర్వాత, దాని నుండి 1 mL బ్యాక్టీరియా ద్రావణాన్ని తీసుకుని, సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా బ్యాక్టీరియా కణాలను సేకరించి, ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణపై వివిధ IPTG గాఢతల ప్రభావాన్ని విశ్లేషించడానికి SDS-PAGEకు గురిచేసి, ఆపై అత్యధిక ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణ కలిగిన IPTG గాఢతను ఎంపిక చేశారు.
ప్రయోగాల తర్వాత, IPTG గాఢత సాధ్యమైనంత ఎక్కువగా ఉండకూడదని తెలుస్తుంది. ఎందుకంటే IPTGకి బ్యాక్టీరియాపై కొంత విష ప్రభావం ఉంటుంది. గాఢతను మించితే కణం చనిపోతుంది; సాధారణంగా చెప్పాలంటే, కణంలో కరిగే ప్రోటీన్ ఎంత ఎక్కువగా వ్యక్తమైతే అంత మంచిదని మనం ఆశిస్తాము, కానీ చాలా సందర్భాలలో IPTG గాఢత చాలా ఎక్కువగా ఉన్నప్పుడు, కణంలో పెద్ద మొత్తంలో చేరికలు ఏర్పడతాయి, కానీ కరిగే ప్రోటీన్ పరిమాణం తగ్గిపోతుంది. అందువల్ల, అత్యంత అనువైన IPTG గాఢత తరచుగా ఎంత ఎక్కువగా ఉంటే అంత మంచిది కాదు, కానీ గాఢత ఎంత తక్కువగా ఉంటే అంత మంచిది.
జన్యుపరంగా మార్పు చేయబడిన స్ట్రెయిన్ల ప్రేరణ మరియు పెంపకం యొక్క ముఖ్య ఉద్దేశ్యం, లక్షిత ప్రోటీన్ దిగుబడిని పెంచడం మరియు ఖర్చులను తగ్గించడం. లక్షిత జన్యువు యొక్క వ్యక్తీకరణ కేవలం స్ట్రెయిన్ యొక్క సొంత కారకాలు మరియు ఎక్స్ప్రెషన్ ప్లాస్మిడ్ ద్వారా మాత్రమే కాకుండా, ఇండ్యూసర్ గాఢత, ప్రేరణ ఉష్ణోగ్రత మరియు ప్రేరణ సమయం వంటి ఇతర బాహ్య పరిస్థితుల ద్వారా కూడా ప్రభావితమవుతుంది. అందువల్ల, సాధారణంగా, ఒక తెలియని ప్రోటీన్ను వ్యక్తీకరించి, శుద్ధి చేయడానికి ముందు, సరైన పరిస్థితులను ఎంచుకుని, ఉత్తమ ప్రయోగాత్మక ఫలితాలను పొందడం కోసం ప్రేరణ సమయం, ఉష్ణోగ్రత మరియు IPTG గాఢత గురించి అధ్యయనం చేయడం ఉత్తమం.
పోస్ట్ చేసిన సమయం: డిసెంబర్ 31, 2021